聚对苯二甲酸乙二醇酯（pet）是一种日常生活中十分常见的聚合物，通常作为矿泉水瓶、饮料瓶、水果和沙拉包装和各种家用电器的外包装材料。目前pet废弃物的数量占据了全球垃圾总量的12%。且pet产品大都是一次性消费品，堆积如山的废旧pet材料短时间内不易降解，会造成环境污染。研究人员早在2005年就发现了能够降解pet的酶，将其与下游绿色工艺相结合可以将pet 单体转化为增值的化学品，有望实现pet 的可持续回收。pet水解酶一般都是从微生物菌落中分离得到，但能够承受高温高盐环境且耐受ph的高活性pet水解酶仍然罕见。
泰国vistec科学技术研究所chayasith uttamapinant等研究人员在人类唾液中发现了一种新的聚对苯二甲酸乙二醇酯（pet）水解酶mg8。mg8在不同的温度和盐度条件下表现出强大的pet塑料降解活性，优于一些天然存在的工程水解酶。研究团队还将pet水解酶转化为共价粘合剂，可用于pet的生物功能化，有望极大地扩展塑料产品的应用领域。研究内容以discovery and genetic code expansion of a polyethylene terephthalate (pet) hydrolase from the human saliva metagenome for the degradation and bio-functionalization of pet为题发表在《angewandte chemie international edition》上。
【pet水解酶的来源】
pet作为食品包装塑料已有几十年的使用历史了，这有可能诱使人类消化系统中产生能够降解pet的水解酶。为了验证这一推测，研究人员检索了一个收集了不同环境来源微生物组数据的公共数据库mgnify，mgnify中包含>140,000个人类样本和>45,000个水生系统样本，其中约 75% 来自海洋系统。人体体液的高盐环境也有利于产生高耐盐性的pet水解酶，同时在与其原生环境相似的环境温度下保持活性。最终筛选出了7个来自海洋环境和3个来自人类微生物组的pet水解酶进行进一步的表征分析。尽管这些水解酶都具有相似的折叠结构，但每种酶的表面电荷（包括全局电荷和局部电荷）是不同的。表面电荷的差异会极大地影响它们的底物识别能力和催化作用。mg1-mg7和mg9酶含有整体酸性表面电荷，其中mg1和mg3含有酸性活性位点，而其余的海洋来源候选酶则具有更多的中性活性位点。mg8是一种来自人类唾液宏基因组的酶，预计表面含有许多碱性残基，整体等电点呈碱性，但其活性位点是中性的。mg10来自人类皮肤微生物组，含有均匀分布的酸性和碱性残留物，因此整体接近中性，同时含有中性活性位点。
图1.从海洋和人类宏基因组学中寻找pet水解酶的工作流程和初步表征
【pet水解酶的表征】
研究人员选择大肠杆菌bl21（de3）作为表达宿主，进一步克隆、表达、纯化和评估了mg1-mg10酶的活性。首先测试了它们水解小分子底物对苯二甲酸二 (2-羟乙基) 酯 (bhet)的能力。mg1、mg7和mg8在水解bhet时最活跃，并且在更高的 nacl 浓度下显示出活性增加。然而，它们在37℃下的bhet水解活性最多仅ispetase活性的27%。这表明，虽然 bhet 水解可能是降解 pet 塑料的前提，但仅凭借pet水解酶对小分子 bhet 的水解效率并不能很好地预测它们对pet塑料的水解能力。接着研究人员着手测试pet酶水解pet 粉末的效率。在37℃时，mg8降解 pet粉末的效率是ispetase的3倍。进一步优化反应温度，当mg8在45-65℃时水解pet粉末时，tpa产量进一步提高5-7倍，mhet产量提高2倍。55℃是mg8的最佳水解温度，该酶在其最佳条件下产生的tpa是ispetase的83倍。mg8在降解 pet 方面的性能优于ispetase。接着，进一步比较了mg8与其他工程化petase变体的活性，mg8仍然表现出显著的优势，它的使用温度更低，水解活性更高。此外，55℃低于pet结晶区的熔点。值得一提的是，迄今为止发现的所有pet水解酶在解聚高结晶pet时都存在着困难，而使用mg8降解的pet粉末结晶度基本保持不变（~30%）。
【mg8降解pet的机理】
mg8的熔化温度(tm)为54℃，ispetase的熔化温度(tm)为42℃。这表明mg8具有更高的耐热性。虽然预测mg8的总体pi为碱性 (9.23)，但蛋白质表面仍存在着的酸性氨基酸簇以及水合盐离子可能有助于蛋白质水合并在较高盐浓度下维持其折叠结构和高活性。mg8的另一个特征在于其扩展序列ryd，所有其他mg酶以及其他已知的pet水解酶都不存在此序列。从mg8中删除 ryd残留物使其pet 粉末降解活性降低了5-30 倍。而向ispetase中添加ryd残基并没有提高 ispetase 的活性，这表明该扩展序列仅能在mg8中表现出优势。此外，在非变性条件下纯化的mg8对pet粉末的水解活性比再折叠的mg8更好，但后者可以以更高的产率生产。mg8易于变性和重新折叠，同时能够保持良好的活性，有望进行大规模生产。
图2. 人唾液宏基因组中的mg8 pet水解酶高效降解pet塑料
【pet水解酶的功能化应用】
pet具有柔韧性和可变形性，是可穿戴传感器基板材料的重要候选者。除了明确pet水解酶的降解能力以外，研究人员还验证了mg8用作 pet表面功能化工具的可行性。在 mg8介导的pet 水解过程中，mg8和pet之间会形成一个短暂的酰基酶中间体。使用2,3-二氨基丙酸 (dap)对mg8进行位点特异性替换，可以稳定捕获这种中间体。加入 dap的mg8通过酰胺键捕获 pet，从而使所得的酶-塑料复合物高度稳定。因此，掺入dap的mg8有望作为共价粘合剂
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