抗体纯化精纯—离子交换层析

　离子交换层析

　　双特异性抗体离子交换层析应用最为广泛，目标物质和带相反电荷的介质以静电力的作用结合，然后在用高离子或改变pH的方式进行洗脱。

　　特别要注意，蛋白的pI表征的是蛋白表面的净电荷，然而离子交换层析时是蛋白的局部电荷和介质作用，另外离子交换介质吸附的一类物质，如阳离子交换介质吸附带正电荷的物质，所以在纯化过程中，需要配合层析过程进来合理的结合及洗脱过程，才能达到预期的结果（原理见图）。

　　图：离子交换层析原理示意图

　　阳离子交换是另一个较常用的抗体捕获方法。至少有4个（Humira、Synagis、Soliris、Zenapax）在欧美上市的治疗性抗体药物采用了这种捕获方法，另外多个处于临床阶段的抗体品种也采用了阳离子交换捕获方法。

　　阳离子交换与ProteinA相比的最大优势是成本。离子交换介质价格仅为ProteinA的1/10，可重复使用百次以上，并耐受强碱清洗。另外，阳离子交换介质的抗体载量可达100g/L，是ProteinA的2-5倍，可降低介质使用量。

　　Arunakumari等开发了一个基于阳离子交换抗体捕获、阴离子交换精纯的两步抗体分离方法。在大大降低纯化成本，缩短纯化时间的同时，阳离子交换层析捕获收率达到82%，捕获后抗体纯度超过97%，作者显示此工艺可成功放大1000倍。

　　阳离子交换与ProteinA相比有两个劣势，一个是特异性差，另一个是通用性差，需针对不同抗体和抗体表达工艺进行优化，如不同抗体的等电点不同。即使是同一抗体，不同的翻译后修饰也造成不同的等电点，这些都影响到阳离子交换缓冲液pH的选择。

　　捕获后的抗体需进一步去除宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、抗体聚集体、抗体片段和脱落ProteinA，以达到对患者安全的纯度。精纯一般采用两步层析以保持足够的纯化冗余，但采用一步精纯的工艺也越来越多。

　　精纯步骤常用的方法包括阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水作用层析、羟基磷灰石层析和分子筛，其中阴离子交换和疏水作用采用流穿模式，阳离子交换和羟基憐灰石采用结合-洗脱模式。各个层析步骤的主要杂质去除能力见表。

　　两步精纯工艺一般会选择一个流穿模式，一个结合-洗脱模式，而单一步骤精纯一般会选择流穿模式（因为捕获步骤为结合-洗脱模式）。精纯介质通常采用高效介质（直径10-30um）以提髙分离的分辨率，同时提髙抗体的回收率。但采用小粒径介质同时也限制了流速，延长了纯化时间。

　　表层析步骤对杂质的清除作用

　　离子交换是最常见的精纯步骤。经典的抗体纯化步骤采用流穿的阴离子交换和结合-洗脱的阳离子交换两步精纯。阴离子交换对宿主细胞核酸和宿主细胞蛋白有很好的清除作用，而阳离子交换是去除多聚体和抗体片段的有效步骤。离子交换依靠抗体和杂质表面所带电荷差异将其分离。

　　抗体的电荷来自多个组成部分。赖氨酸、精氨酸、组氨酸可带负电荷，天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸可带正电荷，N-端的氨基可带正电荷，C-端的竣基可带负电荷，糖基化上唾液酸可带负电荷。

　　抗体上的净电荷取决于抗体的等电点和缓冲液的pH，当缓冲液pH低于等电点时，抗体带正电荷；当pH高于等电点时，抗体带负电荷。所以，通过调整缓冲液的pH，可以改变其在离子交换介质上的结合和流穿。需要指出的是，虽然一半以上氨基酸本身不带电荷，但它们会通过结构影响抗体的表面电荷，也会影响邻近酸性或碱性氨基酸的电荷。

　　阴离子和阳离子交换的区分在于介质上的活性基团，阴离子交换介质上的活性基团为阳性（带正电荷），可吸附流动相中的阴性离子，阳离子交换介质上的活性基团为阴性（带负电荷），可吸附流动相中的阳性离子。活性基团还可进一步分为强活性基团和弱活性基团，区分的标准是活性基团上所带电荷是恒定的还是随pH改变的。抗体纯化使用的一般为强活性介质。